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第一講：傅若農(nóng)講述氣相色譜技術(shù)發(fā)展歷史及趨勢 第二講：傅若農(nóng)：從三家公司GC產(chǎn)品更迭看氣相技術(shù)發(fā)展 第三講：傅若農(nóng)：從國產(chǎn)氣相產(chǎn)品看國內(nèi)氣相發(fā)展脈絡(luò)及現(xiàn)狀 第七講：傅若農(nóng)：酒駕判官——頂空氣相色譜的前世今生 第八講：傅若農(nóng)：一掃而光——吹掃捕集-氣相色譜的發(fā)展 第九講：傅若農(nóng)：凌空一瞥洞察一切——神通廣大的固相微萃取（SPME） 第十講：傅若農(nóng)：懸“珠”濟(jì)世——單液滴微萃取(SDME)的妙用 第十一講：傅若農(nóng)：扭轉(zhuǎn)乾坤——神奇的反應(yīng)頂空氣相色譜分析 第十二講：擒魔序曲——脂質(zhì)組學(xué)研究中的樣品處理 第十三講：離子液體柱——脂質(zhì)組學(xué)中分離脂肪酸的氣相色譜柱 上一講我們主要介紹了在脂質(zhì)組學(xué)中對脂肪酸的分析所用的離子液體毛細(xì)管色譜柱，但是用氣相色譜分析脂肪酸源遠(yuǎn)流長，有許多故事，了解一些過去的故事對現(xiàn)在的發(fā)展理解有好處，溫故才可以知新。 先講一下脂質(zhì)組學(xué)中常常要研究的血漿分析，其中一個重要的項(xiàng)目是分析其中的脂肪酸，下面一個例子，概要介紹了血漿中脂肪酸的主要成分： “雖然游離脂肪酸只占血漿中脂肪酸的一小部分，但它代表一類高度代謝活性的脂質(zhì)，脂肪組織是血漿游離脂肪酸的主要來源，其分布與食物的脂肪酸組成密切相關(guān)。在正常情況下從脂肪組織中釋放脂肪酸與組織對能量的需要緊密相連。但是當(dāng)代謝失調(diào)時，這種平衡被打亂，導(dǎo)致脂解增加，會釋放出多于組織所需要脂肪酸的量。健康人經(jīng)過一夜禁食后血漿中含有214 nmol/ml游離脂肪酸，油酸(18:1)的含量最高，其次是棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)，這三種酸占全部游離脂肪酸的78%。亞油酸(18:2)和花生四酸(20:4) 是主要的多不飽和脂肪酸(約占8%)。但是有營養(yǎng)作用的α-亞麻酸(18:3ω-3)，二十碳五烯酸(20:5, EPA)和二十二碳六烯酸(22:6, DHA)也占有一定比例，約為全部游離脂肪酸的1%�！� 1 脂肪酸氣相色譜分析的歷史故事 氣相色譜被認(rèn)為是分析復(fù)雜混合物中脂肪酸的可靠方法，這一方法可追述到上世紀(jì)50年代，氣相色譜的出現(xiàn)于脂肪酸的分析有密切的關(guān)系，1952年氣相色譜發(fā)明人A. T. James 和 A. J. P. Martin就用最為原始的自制氣相色譜儀分析小分子脂肪酸(Biochem J,1952,50:679),他們首次闡明氣-液分配氣相色譜的原理，設(shè)計(jì)了自動滴定檢測脂肪酸的氣相色譜儀。實(shí)驗(yàn)過程中使用的色譜柱為玻璃柱，其內(nèi)徑為4mm，長度為5英尺，固定相是把DC 550硅油涂漬在硅藻土Celite 545上。分離小分子脂肪酸的色譜如圖1所示。
圖1 用自動滴定計(jì)氣相色譜儀分析小分子脂肪酸的色譜圖 分離從乙酸到戊酸的色譜如圖2所示：
圖 2 分離從乙酸到戊酸的色譜 此后分析脂肪酸的一個重大進(jìn)步是把脂肪酸進(jìn)行甲酯化，1956年James和Martin使用氣體密度檢測器，并把脂肪酸進(jìn)行甲酯化，使用阿皮松類高溫潤滑脂作固定相，可以分離分子量大的脂肪酸。圖3 是分離C5-C13直鏈和支鏈脂肪酸甲酯的色譜圖。
圖 3 用高沸點(diǎn)潤滑脂分離C5-C13直鏈和支鏈脂肪酸甲酯的色譜圖 色譜柱：在硅藻土載體上涂漬高沸點(diǎn)潤滑脂；柱溫：197℃；載氣：氮?dú)?14.1mL/min; 色譜峰: (1) 空氣, (2) n-戊酸甲酯，(3) n-己酸甲酯, (4) 4-甲基己酸甲酯, (5) 6-甲基庚酸甲酯, (6) n-辛酸甲酯, (7) 6-甲基辛酸甲酯, (8) n-壬酸甲酯, (9) 8-甲基壬酸酯, (10) n-癸酸酯, (11) 8-甲基癸酸酯, (12) 10-甲基十一酸酯 , （13) n-十二酸酯, (14) 10-甲基十二酸酯 2 脂肪酸氣相色譜分析的發(fā)展 脂肪酸的氣相色譜分析由于它的極性和揮發(fā)性不好而帶來麻煩，所以首先要把它的極性羰基轉(zhuǎn)化成易于揮發(fā)的非極性衍生物。有多種烷基化試劑可以進(jìn)行羰基的衍生化，使用最多的是進(jìn)行甲基化，特別是使用氫火焰離子化監(jiān)測器(FID)氣相色譜時，尤為方便普及。但是使用FID也有一些不足之處。絕對的定量要依靠內(nèi)標(biāo)物的信號強(qiáng)度，經(jīng)常使用的內(nèi)標(biāo)物是十七酸(而不是使用化學(xué)和物理性質(zhì)與所測定脂肪酸相近的同位素標(biāo)記脂肪酸混合物作內(nèi)標(biāo))。人類體內(nèi)不能合成奇數(shù)碳鏈的脂肪酸(包括碳17酸)，但是人們可以通過食物攝取它們，它們存在于血液的血漿中，增加內(nèi)標(biāo)物十七酸的量，從而擾亂定量分析。 進(jìn)一步講，F(xiàn)ID不能提供分子質(zhì)量或其他結(jié)構(gòu)特征信息，以便區(qū)分不同的脂肪酸，所以色譜和FID只是解決把所有要研究的脂肪酸分子完全分離開，用質(zhì)譜解決脂肪酸的結(jié)構(gòu)信息。大家應(yīng)該知道使用電子轟擊電離脂肪酸分子很容易被打成碎片，通過這些碎片可以進(jìn)行脂肪酸的結(jié)構(gòu)分析，但是靈敏度受到限制。弱電離技術(shù)比如負(fù)化學(xué)電離(NCI)可以改善檢測限。使用鹵代衍生化試劑可以進(jìn)一步提高檢測靈敏度，這種試劑增加了電子親和力，可改善NCI-MS的靈敏度。Kawahara 使用五氟基芐(PFB) 作衍生化試劑來衍生化有機(jī)羧酸，這樣的含氟衍生物電子很容易被俘獲。此后這一方法擴(kuò)展到脂肪酸的衍生化為脂肪酸酯，與脂肪酸甲酯相比，它很容易被NCI-MS檢測。所以使用五氟基芐進(jìn)行衍生化有利于提高檢測靈敏度。許多研究者使用PFB做衍生化試劑進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)中的脂肪酸分析，例如Quehenberger等就是用這一方法分析巨噬細(xì)胞中的各種脂肪酸(Prostaglandins, Leukotrienesand Essential Fatty Acids，2008，79：123–129)。下圖4 是分析巨噬細(xì)胞中的各種脂肪酸的色譜圖。
圖 4 巨噬細(xì)胞中的各種脂肪酸的色譜圖 圖中色譜峰的脂肪酸如下： (1)12:0; (2)14:0; (3)15:0; (4)16:1; (5)16:0; (6)17:1; (7)17:0;(8) a18:3; (9) 18:4; (10) g18:3; (11)18:2; (12)18:1; (13)18:0; (14)20:4;(15)20:5; (16)11,14,17–20:3;(17)bishomo-20:3; (18)20:2; (19)5,8,11–20:3; (20)20:0; (21)22:6; (22)22:4; (23)22:5; (24)22:2;(25)22:3; (26)22:1; (27)22:0; (28) 23:0; (29)24:1; (30)24:0; 3 國內(nèi)外進(jìn)行氣相色譜分析脂肪酸的一些例證 為了進(jìn)一步了解進(jìn)行氣相色譜分析脂肪酸的具體情況，下面表1列出近50例分析各種樣品中脂肪酸的色譜柱和分離對象。表2列出國外文獻(xiàn)中分析人體組織中脂肪酸的例證。 表 1 國內(nèi)氣相色譜分析脂肪酸的色譜柱和分析對象
表 2 國外文獻(xiàn)中有關(guān)分析人體組織中脂肪酸的衍生化方法和所用色譜柱
4 脂肪酸氣相色譜分析所用色譜柱 從已發(fā)表的文獻(xiàn)看分析整體脂肪酸需用非極性的聚硅氧烷毛細(xì)管色譜柱，如聚二甲基硅氧烷，分離多不飽和脂肪酸需用極性強(qiáng)的色譜柱，如OV-275，OV-275(這是聚硅氧烷固定相中極性最強(qiáng)的色譜柱)和CP-Sil 88(HP-88)。 據(jù)安捷倫公司一份研究報告(5989-3760 EN)，他們對最重要的一些脂肪酸(甲酯)(見表3)進(jìn)行研究，研究總結(jié)認(rèn)為：聚乙二醇柱對不太復(fù)雜的樣品可以得到很好的分離;而中等極性的氰丙基聚硅氧烷柱(DB 23)對復(fù)雜的 FAMEs 樣品可以得到很好的分離，對一些順反異構(gòu)體也可以得到分離; 要使順反異構(gòu)體分離的更好，就要使用更高極性的 HP-88 氰丙基色譜柱。 表3 重要的一些脂肪酸
三種主要色譜柱分離脂肪酸的特點(diǎn)如下：
使用DB-Wax柱，DB-23 柱和HP-88 柱上分離37種脂肪酸混合物的色譜見圖5-圖7.
圖 5 FAMEs在30 m 0.25 mm ID, 0.25 μm DB-Wax 色譜柱上的色譜
圖 6 FAMEs混合物在 60 m 0.25 mm ID, 0.15 μm DB-23 柱上的色譜
圖 7 FAMEs 混合物 在 100 m 0.25 mm ID, 0.2 μm HP-88 柱上 的色譜 其中HP-88 柱的極性最強(qiáng)，是含88%氰丙基甲基聚硅氧烷，其結(jié)構(gòu)如下圖8：
圖8 HP-88 的分子結(jié)構(gòu) HP-88 對一些異構(gòu)體的分離能力由于DB-23如下圖9所示
圖 8 HP-88和HP-23分離能力的差別 (此圖來自Walter Jennings博士2008年在北京大學(xué)作報告時的ppt文稿) 吳惠勤等使用P-88毛細(xì)管色譜柱分離了39種脂肪酸得到的質(zhì)譜基峰離子和特征離子如表4中的數(shù)據(jù)。 表4 39種脂肪酸在HP-88毛細(xì)管色譜柱上出峰次序 ( 吳惠勤等，分析化學(xué)，2007，35(7)：998-1003)
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編者注：傅若農(nóng)教授生于1930年，1953年畢業(yè)于北京大學(xué)化學(xué)系，而后一直在北京理工大學(xué)(原北京工業(yè)學(xué)院)從事教學(xué)與科研工作。1958年，傅若農(nóng)教授開始帶領(lǐng)學(xué)生初步進(jìn)入吸附柱色譜和氣相色譜的探索;1966到1976年文化大革命的后期，傅若農(nóng)教授在干校勞動的間隙，系統(tǒng)地閱讀并翻譯了兩本氣相色譜啟蒙書，從此進(jìn)入其后半生一直從事的事業(yè)——色譜研究。傅若農(nóng)教授是我國老一輩色譜研究專家，見證了我國氣相色譜研究的發(fā)展，為我國培養(yǎng)了眾多色譜研究人才。
