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目前對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)按原理主要分為針對(duì)外源蛋白質(zhì)和針對(duì)外源DNA兩種鑒定技術(shù)。
外源蛋白質(zhì)的測(cè)定
即從蛋白質(zhì)水平對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)際應(yīng)用中主要采用的是免疫學(xué)檢測(cè)法，即Western雜交、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和試紙條法。免疫學(xué)檢測(cè)法可以檢測(cè)具有抗原性的蛋白質(zhì)類(lèi)表達(dá)產(chǎn)物的存在，它是通過(guò)抗原抗體特異反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【W(wǎng)estern雜交】Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，具有很高的靈敏性，可以從植物細(xì)胞總蛋白中檢測(cè)出50ng的特異蛋白。Western雜交檢測(cè)的關(guān)鍵是抗體的制備。
【酶聯(lián)免疫吸附法】ELISA建立了固-液抗原抗體反應(yīng)體系，并采用酶標(biāo)記，抗體與抗原的結(jié)合通過(guò)酶反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。由于酶的放大作用，使測(cè)定的靈敏度極高，可檢測(cè)出1pg的目標(biāo)物，同時(shí)酶反應(yīng)還具有很強(qiáng)的特異性。它的檢測(cè)原理和過(guò)程基本與Western雜交檢測(cè)相似。
【試紙條法】此法是在最近15年發(fā)展起來(lái)的，之前主要用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。與ELISA相似，這種測(cè)定方法是將特異的抗體交聯(lián)到試紙條上和有顏色的物質(zhì)上，當(dāng)紙上抗體和特異抗原結(jié)合后，再和帶有顏色的特異抗體進(jìn)行反應(yīng)，就形成了帶有顏色的三明治結(jié)構(gòu)，并且固定在試紙條上，如果沒(méi)有抗原，則沒(méi)有顏色。因此整個(gè)操作相對(duì)簡(jiǎn)單一些。目前市場(chǎng)上也出現(xiàn)了一些此類(lèi)測(cè)試的試紙盒。
外源蛋白質(zhì)檢測(cè)法快速，具有一定的靈敏度，也能進(jìn)行半定量，尤其是試紙條法，不需要特殊的儀器設(shè)備，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)或初篩。但外源蛋白質(zhì)檢測(cè)法有三方面的局限性：(1)由于抗原抗體反應(yīng)的專(zhuān)一性，每種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品都要開(kāi)發(fā)和建立專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)試劑和方法，而轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品種類(lèi)繁多，要建立所有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的蛋白質(zhì)檢測(cè)法工作量很大;(2)對(duì)于加工過(guò)的轉(zhuǎn)基因食品，其蛋白質(zhì)很容易被破壞，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確行;(3)有些插入基因還具有表達(dá)部位特異性，這些金銀的表達(dá)并不像DNA那樣存在轉(zhuǎn)基因作物的任何部位，甚至有的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的插入基因根本不表達(dá)或表達(dá)量很低。這些都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。
外源DNA的檢測(cè) 目前對(duì)于外源基因的檢測(cè)主要是通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)入的外源基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行紫外或熒光檢測(cè)。PCR技術(shù)全稱(chēng)“聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)”，是一種在體外由引物引導(dǎo)的DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)，能在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地將目的序列大量復(fù)制。在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方面，主要是用于從DNA即基因水平來(lái)鑒定被測(cè)食品。由于它的快速、靈敏、費(fèi)用低、檢測(cè)僅需微量的DNA并且可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，正成為這一領(lǐng)域日趨成熟的方法之一。
【定性PCR】轉(zhuǎn)基因食品重組DNA的基本機(jī)構(gòu)包括啟動(dòng)子、目的基因、終止子和標(biāo)記基因。由于目的基因種類(lèi)繁多，所以先用轉(zhuǎn)基因食品最常用的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子CaMV35S、轉(zhuǎn)錄終止子NOS及抗生素抗體基因NPTII三個(gè)序列來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)結(jié)果陽(yáng)性者可再檢測(cè)目的基因。
【定量PCR】PCR反應(yīng)具有高度特異性和敏感性，但對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的要求很高，其結(jié)果易受許多因素的干擾而產(chǎn)生誤差，一般PCR只用作轉(zhuǎn)基因食品的定性篩選檢測(cè)。針對(duì)所存在的問(wèn)題，研究人員在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中引入內(nèi)部參照反應(yīng)，以消除檢測(cè)時(shí)的干擾，并與已知含量的序列GMO標(biāo)準(zhǔn)樣的PCR結(jié)果進(jìn)行比較，從而可以半定量地檢測(cè)待測(cè)樣品的GMO含量。
近年來(lái)定量競(jìng)爭(zhēng)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR都已用于轉(zhuǎn)基因食品的定量檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)性定量的基本原理是用人工設(shè)計(jì)的競(jìng)爭(zhēng)模板以不同稀釋度與標(biāo)本共同擴(kuò)增，以競(jìng)爭(zhēng)模板的稀釋度和結(jié)果做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，判斷標(biāo)本中待測(cè)核酸的量。
實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量的方法。這種檢測(cè)方法采用獨(dú)特全封閉反應(yīng)，只須在加樣時(shí)打開(kāi)一次蓋子，減少了污染，具有高度的靈敏性。
【PCR-ELISA】這是一種將PCR的高效性與ELISA高特異性結(jié)合在一起的檢測(cè)方法，它利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與固相板上特異的探針結(jié)合，再加入抗地高辛或生物素的酶標(biāo)抗體-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最后使底物顯色，在酶標(biāo)儀上讀取數(shù)值。利用PCR-ELISA法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)，靈敏度比歐盟推薦的PCR方法高5-10倍。它快速方便，避免了有毒物質(zhì)EB的使用，適合大批量自動(dòng)檢測(cè)。 |
